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保存：2～8℃

保存温度：试本品包含AB包装。A包：2～8℃/RT(常温运输)；B包：-20℃。
产品内容：
注意：I型超声裂解法(KD1338)与II型酶解法(KD1337)均适用于可溶性GST标签蛋白的纯化。
产品说明：
重组蛋白N端的GST谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S Transferase)能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化GST标记蛋白的重要方法。
本试剂盒可用于2次GST蛋白纯化(50mL体积的细菌)，提供5mL浓度为50%的谷胱甘肽-Agarose介质，可吸附5～20mg的GST标记蛋白质。本试剂盒只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没形成包涵体的GST标记蛋白。
操作步骤：
一、重组蛋白的表达和细菌收集
1.37℃振荡培养50mL含表达质粒的细菌到OD600=0.6-0.8。
2.加IPTG到终浓度为0.1mM，30℃振荡培养3h或22℃振荡培养8h(或过夜)。
3.4℃，5000g离心10min收集50mL表达菌液，弃上清。
4.用30mL的1×PBS缓冲液重悬细菌沉淀，4℃，5000g离心10min，弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。
二、谷胱甘肽层析柱的准备
1.将谷胱甘肽-琼脂糖介质充分混匀后，取2.5mL加入到预放了一片筛板的层析柱中。
2.用7.5mL预冷的1×PBS缓冲液洗柱，共三次。
三、裂解
1)超声破碎细菌：在50mL的细菌沉淀中加入2.5mL冰浴的超声裂解缓冲液，再加入125μL PMSF(10mg/mL)溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。
2)酶法裂解细菌：加入2.5mL冰浴的酶解液，再加入25μL PMSF(10mg/mL)溶液，冰上放置30分钟。
四、纯化
1.将超声或酶法得到的细胞裂解物在13000g，4℃离心10min，去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性GST标记蛋白。预留少量(如100μL)作为裂解液留样，其余用于纯化。
2.将上清液加入谷胱甘肽层析柱中，层析柱预先用盖子将底端的漏液口堵上。让细菌裂解液和介质在4℃结合1-12h后放开底端的盖子让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于SDS-PAGE电泳。
注意：可将穿透液重新加入此层析柱中，以提高结合率。
3.用10mL 1×PBS缓冲液洗柱，收集并保存穿透液(含杂蛋白)并预留100μL作为穿透液留样，其余在确认实验成功后再丢弃。
4.用0.2～0.5mL的GST洗脱液洗柱，收集并保存穿透液，此穿透液即纯化的GST标记蛋白样品。由于它可能含蛋白酶污染，所以纯化样品不能在4℃长期保存，需留100μL左右用于后续浓度测定或/和SDS-PAGE电泳，其余放-80℃保存。
5.用裂解液留样(四-1)、穿透液留样(四-3)和纯化样品留样(四-4)进行蛋白定量或/和SDS-PAGE分析。
注意：本操作没有预先脱盐，故只能用Bradford法或OD检测法测定裂解液留样、穿透液留样和样品留样的蛋白浓度。按OD检测法，1 OD(280nm)约等于0.5mg/mL蛋白。由于GST的分子量为26 KD，所以在SDS-PAGE胶上，GST标记蛋白将比天然蛋白大26 KD。
五、再生(自备试剂)
1.用3倍介质体积的6M盐酸胍处理柱子10分钟。介质为2mL则用6mL，下同。
2.用3倍介质体积的超纯水处理柱子10分钟。
3.用3倍介质体积的缓冲液一(0.5M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH8.5)处理柱子10分钟。
4.用3倍介质体积的缓冲液二(0.5M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH4.5)处理柱子10分钟。
5.再重复3～4步两次。
6.用3倍介质体积的超纯水处理柱子3次。
7.若需要立即使用，则用3倍介质体积的1×PBS缓冲液处理柱子2次。堵上漏口，加3倍介质体积的1×PBS缓冲液洗涤后立即使用。
8.若长时间不用，则上步的1×PBS改成20%的乙醇，其余操作完全相同。
相关搜索：GST标签蛋白纯化试剂盒II型(酶解)，GST-Tag Protein purification Kit II